Biologia
  Wiw.pl   Na bieżąco:  Informacje   Co nowego   Matematyka i przyroda:  Astronomia   Biologia   Fizyka   Matematyka   Modelowanie rzeczywistości   Humanistyka:  Filozofia   Historia   Kultura antyczna   Literatura   Sztuka   Czytaj:  Biblioteka   Delta   Wielcy i więksi   Przydatne:  Słowniki   Co i gdzie studiować   Wszechświat w obrazkach    
 Jesteś tutaj:  Wirtualny Wszechświat > Biologia > Genetyka > Genetyka molekularna 
  Indeks
Genetyka
Historia odkryć . . .
Podstawy genetyki
Genetyka molekularna
Klonowanie genów
Banki genów
Banki cDNA
Wektory . . .
Sekwencjonowanie . .
Struktura genu i . . .
Wielkość genomu
Specjalistyczne . . .
Czynniki . . .
Geny i ewolucja
Świat wirusów i . . .
Inżynieria genetyczna
Słowniczek
  Źródło
Wybrane fragmenty pochodzą z książki
Język genów autorstwa Paul'a Berg'a i Maxine Singer


  Twożenie banków genów
 
Klony i biblioteki
 
P
rzyjrzyjmy się krokom koniecznym do sklonowania genu. Najpierw duży, złożony genom tnie się enzymami restrykcyjnymi, a następnie całą populację różnych fragmentów DNA miesza z populacją jednakowych cząsteczek wektora, które zostały przecięte w określonym miejscu tą samą nukleazą. Przez łączenie się komplementarnych lepkich końców cząsteczek wektora z końcami fragmentów wstawki powstają zrekombinowane cząsteczki DNA. Wstawione fragmenty dołącza się następnie do wektora DNA wykorzystując odpowiednie ligazy. Dzięki temu uzyskuje się populację cząsteczek DNA, z których wiele zbudowanych jest teraz z DNA wektora oraz z jednego z ogromnej liczby fragmentów genomowych. Pozostałe cząsteczki w populacji to wektory, które nie mają wstawek lub takie, które zawierają ich wiele. Ostatecznym celem jest sklonowanie zrekombinowanej cząsteczki DNA, która zawiera żądany gen. W tym momencie musimy znać odpowiedź na ważne pytanie: ile zrekombinowanych cząsteczek DNA trzeba otrzymać, aby mieć pewność, że każdy region analizowanego genomu, włącznie z poszukiwanym genem, jest reprezentowany w kolekcji?
       Przypomnijmy, że normalna diploidalna komórka ludzka zawiera sześć miliardów par zasad DNA. To znaczy, że potrzeba minimum 300 000 zrekombinowanych cząsteczek DNA zawierających wstawki o średniej długości 20 000 par zasad, aby reprezentowany był cały genomowy DNA. Pocięcie DNA na fragmenty o większej lub mniejszej długości wymagałoby mniej lub więcej zrekombinowanych cząsteczek DNA, żeby uzyskać ten sam wynik. W praktyce, żeby być pewnym pełnej reprezentacji, uwzględniając zarazem fakt, że wiele cząsteczek DNA wektora nie nabędzie wstawki – potrzeba kilkakrotnie większej liczby zrekombinowanych cząsteczek DNA aniżeli to teoretyczne minimum.
       Następne kroki wymagają oddzielenia poszczególnych elementów populacji cząsteczek DNA przez sklonowanie. Klonowanie jest procedurą wieloetapową. Najpierw do roztworu, w którym znajdują się zrekombinowane cząsteczki DNA dodaje się komórki, w których wektor może się powielać. Komórki pobierają DNA; w odpowiednio dobranych warunkach każda z nich uzyskuje tylko jedną jego cząsteczkę. Następnie zawiesinę komórkową rozprowadza się cienką warstwą na szalkach z pożywką, aby poszczególne komórki były od siebie oddalone. W tym czasie cząsteczki wektora – zarówno zawierające wstawki, jak i ich nie zawierające – rozpoczynają replikację wewnątrz komórek. Jeśli jako wektora użyto fagów lub innych wirusów, w rezultacie tego procesu otrzymuje się populację łysinek fagowych w szalkach z komórkami bakteryjnymi lub łysinek wirusowych w szalkach z komórkami zwierzęcymi. Jeśli użyto wektorów plazmidowych, poszczególne cząsteczki DNA znajdują się w oddzielnych koloniach bakteryjnych. W ten właśnie sposób uzyskuje się klony w zasadzie wszystkich zrekombinowanych cząsteczek DNA albo pod postacią łysinek, albo kolonii. Następny problem do rozwiązania to zidentyfikowanie żądanego klonu i namnożenie go w celu otrzymania odpowiedniej ilości zrekombinowanego DNA. Z praktycznego punktu widzenia dobrze jest najpierw pozbyć się tych wszystkich łysinek i kolonii, które zawierają wektory bez wstawek.
       Większość wektorów plazmidowych ma jeden lub więcej genów kodujących oporność na antybiotyk. Geny te można wykorzystać do rozróżnienia kolonii zawierających zrekombinowany DNA od tych, które zawierają nie zmienioną cząsteczkę DNA wektora, bądź od takich, które nie zawierają plazmidu. W eksperymentach z DNA najbardziej użyteczny jest wektor plazmidowy przenoszący różne geny oporności na antybiotyk (na przykład na tetracyklinę i ampicylinę). Komórki-gospodarze, które zawierają taki plazmid, rosną w obecności jednego lub obu antybiotyków, natomiast te, które nie pobrały wektora, nie będą rosły wcale. Dodanie antybiotyku do pożywki wyeliminuje więc jedną grupę niepotrzebnych nam kolonii komórek – tych bez plazmidów.
Wektor plazmidowy z dwoma genami oporności na antybiotyki ułatwia izolację komórek zawierających zrekombinowany DNA
       Takie geny ma powszechnie stosowany wektor plazmidowy. Znana jest jego pełna sekwencja nukleotydowa, licząca ponad 4000 par zasad. Obrączka opasująca plazmid oznacza miejsce, w którym zaczyna się replikacja plazmidowego DNA. Pozostałych genów nie zaznaczono. Litery oraz główki strzałek wskazują miejsca, w których plazmid może być przecinany przez różne enzymy restrykcyjne. Zauważmy, że dla każdej restryktazy jest tylko jedno takie miejsce. DNA wektora można przeciąć w każdym z tych miejsc, używając właściwego enzymu. W każdym z nich może zostać wprowadzony odcinek obcego DNA, pod warunkiem że wektor i wprowadzane fragmenty mają pasujące do siebie lepkie końce. Cała sztuka polega na tym, by cząsteczkę obcego DNA umieścić w obrębie jednego z genów oporności, na przykład w miejscu Pu lub B. Kolonie komórek zawierające zrekombinowane wektory można wtedy łatwo odróżnić od zawierających nie zmienione plazmidy, ponieważ te pierwsze nie są już oporne na jeden z antybiotyków – gen oporności został bowiem uszkodzony przez insercję. Przy pracy z fagami i wirusami stosuje się wiele podobnych sztuczek. W końcu pozostają już tylko te klony, które zawierają zrekombinowane cząsteczki DNA – to znaczy takie, które mają wstawkę. Taki zbiór klonów nazywany jest biblioteką zrekombinowanego DNA. Każdy element biblioteki, czy to komórka bakteryjna, fag czy wirus, zawiera unikalny odcinek ludzkiego (lub pochodzącego od myszy, kukurydzy czy też muszki owocowej) genomu. Takie biblioteki można przechowywać, stanowią więc trwałe zasoby. Można z nich wyizolować wiele różnych genów.
       W jaki sposób szuka się w bibliotece zrekombinowanego DNA – tego, który zawiera wstawiony gen będący przedmiotem naszego zainteresowania? Jakkolwiek do rozwiązania tego problemu stosuje się wiele różnych metod, tutaj opiszemy nieliczne, aby zilustrować ogólne zasady. Poszukiwania żądanego klonu muszą opierać się na unikalnych i wykrywalnych cechach wstawki. Są tylko dwie klasy takich właściwości: pierwsza to sekwencja par zasad DNA wstawki. Druga to białko kodowane przez gen występujący w sklonowanym fragmencie. Te dwie unikalne cechy wykorzystuje się na różne sposoby do przeszukiwania wielkich ilości klonów i identyfikacji tego, który nas interesuje. Metody są na tyle wybiórcze, że pozwalają „wyłowić” jeden klon spośród wielu ich milionów w ciągu zaledwie kilku dni pracy laboratoryjnej. Ponieważ odcinki DNA i białka, które kodują różnią się między sobą, wybranie klonu z biblioteki wymaga dostosowanych indywidualnie metod.
Rozdzielenie klonów przez hybrydyzację z radioaktywną snodą
       Jedna z najczęściej używanych technik jest zarazem bardzo prosta. Podobnie jak wiele innych procedur selekcyjnych – a w rzeczywistości większość metod genetyki molekularnej – wykorzystuje rozplatanie i splatanie się komplementarnych nici DNA. Tysiące łysinek fagowych lub setki kolonii bakteryjnych na szalce z agarem przenosi się na stałe krążki (zazwyczaj z nitrocelulozy), które po prostu przykłada się na chwilę do powierzchni szalki. Położenie łysinek lub kolonii na nitrocelulozowej odbitce jest dokładnie takie samo jak na szalce. Krążek zanurza się następnie w odpowiednim roztworze, w którym dwie nici DNA w łysinkach lub koloniach ulegają rozpleceniu. Wtedy przenosi się go do innego roztworu zawierającego pojedynczą nić DNA (lub RNA), której sekwencja jest komplementarna do jednej z nici w żądanym klonie. Ten DNA (lub RNA) jest, w celu łatwego wykrywania, wyznakowany, zazwyczaj radioaktywnym izotopem. Gdy wyznakowana pojedyncza nić zwiąże się z właściwym rekombinantem na krążku, w miejscu odpowiadającym położeniu rekombinanta na oryginalnej szalce pozostaje radioaktywna plamka. Wtedy z łatwością można odzyskać niewielką liczbę fagów lub kolonii bakteryjnych, które znajdują się jeszcze na agarze. Wyznakowany DNA lub RNA nazywa się wówczas sondą – służy on jako narzędzie umożliwiające odnajdywanie określonej sekwencji nukleotydowej.
       Jeśli nie znamy sekwencji nukleotydowej żądanego odcinka, a więc nie mamy odpowiedniej sondy, stosuje się inne procedury identyfikacji. Trzeba wtedy znaleźć klon, który syntetyzuje białko interesującego nas genu. To podejście wymaga zastosowania specjalnych wektorów, pozwalających na transkrypcję i translację sklonowanych genów. Czasami białko wyposaża komórki-gospodarzy w jakąś specjalną funkcję, która umożliwia ich rozpoznanie. W innych przypadkach poszukiwaną zrekombinowaną cząsteczkę DNA wykrywa się stosując przeciwciała specyficzne wobec kodowanego przez nią białka.
       Zidentyfikowany klon można po prostu wyskubać igłą z agaru. Następnie komórki lub wirusy przenoszące zrekombinowany DNA namnaża się w odpowiednich warunkach laboratoryjnych. Na koniec sklonowany zrekombinowany DNA oczyszcza się chemicznie z pozostałych składników komórki czy wirusa. Kiedy mamy już wystarczającą ilość tego DNA, można go wykorzystać do różnych celów laboratoryjnych. „Wystarczająca ilość” to zazwyczaj ilość rzędu miligramów (tysięcznych części grama). Wydawać by się mogło, że nie jest to dużo, ale przy czułości nowoczesnych metod badawczych miligram DNA to nawet więcej niż potrzeba do przeprowadzenia jakiegokolwiek eksperymentu. Hodowanie sklonowanych komórek, fagów czy wirusów jest bardzo proste i stanowi niewyczerpane źródło zrekombinowanego DNA. Istnieją proste i niezawodne metody ciągłego utrzymywania bibliotek, kolonii sklonowanych komórek oraz wirusów, do zapoczątkowania zaś ich wzrostu i namnażania wystarczy zaledwie jedna komórka lub jedna cząstka wirusa.
góra strony
poprzedni esej następny esej
Wiw.pl  |  Na bieżąco  |  Informacje  |  Co nowego  |  Matematyka i przyroda  |  Astronomia  |  Biologia  |  Fizyka  |  Matematyka  |  Modelowanie rzeczywistości  |  Humanistyka  |  Filozofia  |  Historia  |  Kultura antyczna  |  Literatura  |  Sztuka  |  Czytaj  |  Biblioteka  |  Delta  |  Wielcy i więksi  |  Przydatne  |  Słowniki  |  Co i gdzie studiować  |  Wszechświat w obrazkach