Biologia
  Wiw.pl   Na bieżąco:  Informacje   Co nowego   Matematyka i przyroda:  Astronomia   Biologia   Fizyka   Matematyka   Modelowanie rzeczywistości   Humanistyka:  Filozofia   Historia   Kultura antyczna   Literatura   Sztuka   Czytaj:  Biblioteka   Delta   Wielcy i więksi   Przydatne:  Słowniki   Co i gdzie studiować   Wszechświat w obrazkach    
 Jesteś tutaj:  Wirtualny Wszechświat > Biologia > Genetyka > Genetyka molekularna 
  Indeks
Genetyka
Historia odkryć . . .
Podstawy genetyki
Genetyka molekularna
Klonowanie genów
Sekwencjonowanie . .
Struktura genu i . . .
Wielkość genomu
Specjalistyczne . . .
Czynniki . . .
Geny i ewolucja
Świat wirusów i . . .
Inżynieria genetyczna
Słowniczek
  Źródło
Wybrane fragmenty pochodzą z książki
Język genów autorstwa Paul'a Berg'a i Maxine Singer


  Sekwencjonowanie i mapowanie genów
 
Mapowanie i anatomia
sklonowanego DNA
 
P
ierwszym krokiem w analizie sekwencji sklonowanego odcinka DNA jest ustalenie, jak uszeregowane są na nim miejsca cięcia enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne, o czym była mowa wcześniej, przecinają duże cząsteczki DNA, dając powtarzalne zbiory stosunkowo niewielkich fragmentów DNA. Fragmenty te można rozdzielić ze względu na ich wielkość dzięki elektroforezie w półpłynnym żelu. Ogólnie rzecz biorąc, im krótszy jest taki dwuniciowy odcinek, tym szybciej porusza się on w polu elektrycznym. Stosując różne rodzaje elektroforezy, można rozdzielać fragmenty liczące od dwudziestu do milionów par zasad. Używając wzorców, czyli odcinków o znanej wielkości, można łatwo określić wielkość badanego fragmentu posługując się linijką i prostym wykresem. Do przeprowadzenia analizy wystarcza zwykle mniej niż mikrogram (milionowa część grama) DNA, ponieważ odcinki DNA można łatwo wykryć po wybarwieniu ich odpowiednim barwnikiem.
       Zestaw fragmentów powstających w wyniku działania określonej restryktazy stanowi swoisty„odcisk palca” wyjściowego DNA. Analizując fragmenty powstałe w wyniku działania różnych enzymów restrykcyjnych oraz ich rozmaitych kombinacji, można często ustalić kolejność występowania badanych fragmentów w wyjściowej cząsteczce DNA. W rezultacie otrzymujemy fizyczną mapę DNA, która, jeśli jest wystarczająco szczegółowa, jednoznacznie opisuje oryginalną cząsteczkę DNA. Zrekombinowane wektory są zwykle niewielkie, skonstruowanie ich mapy fizycznej nie przedstawia więc dużych trudności. Jednak trawienie enzymami restrykcyjnymi dużych cząsteczek DNA daje złożone zestawy fragmentów. Bardzo użyteczne do sporządzania map takich cząsteczek, na podstawie analizy zestawów ich fragmentów, są specjalne programy komputerowe.
       Często drugim etapem analizy strukturalnej jest ustalenie, gdzie w sklonowanym odcinku DNA znajduje się gen, w którym na przykład fragmencie restrykcyjnym i czy obecny jest cały ten gen, czy też tylko jego część? Podstawową wykorzystywaną w tym celu własnością jest znowu splatanie się rozplecionego fragmentu DNA z sondami cDNA (lub RNA). Odcinki DNA można przenieść z żelu elektroforetycznego na arkusz folii bez naruszenia układu rozdzielonych odcinków DNA. Po zetknięciu żelu z arkuszem, na przykład nitrocelulozy, odpowiedni roztwór przesiąka przez żel i nitrocelulozę, przenosząc fragmenty DNA z żelu na arkusz nitrocelulozowy, na którym są one fizycznie zatrzymywane. Obie nici DNA na arkuszu zostają rozplecione i, dokładnie tak jak w metodzie używanej do odnajdywania klonu, arkusz zanurza się następnie w roztworze zawierającym wyznakowaną sondę w postaci jednoniciowego DNA (lub RNA) komplementarnego do poszukiwanego odcinka. Jeśli, na przykład, sonda jest wyznakowana izotopem, prążek na arkuszu staje się radioaktywny i ujawnia położenie, a zarazem wielkość odcinka DNA zawierającego interesujący nas gen. Pozwala to na ustalenie pozycji danego fragmentu na sporządzanej mapie.
Metoda Southerna
Hybrydyzacja genomowa
       Procedura ta, znana pod angielską nazwą blotting DNA1 jest szeroko stosowana; służy ona nie tylko do charakteryzowania sklonowanych DNA. Jednym z najważniejszych zastosowań tej metody jest odnajdywanie wśród wielu, wielu innych, tego fragmentu DNA, w którym występuje poszukiwany gen. Mieszanina fragmentów uzyskana po potraktowaniu całkowitego komórkowego DNA enzymem restrykcyjnym może być elektroforetycznie rozdzielona. Jeśli genom jest bardzo duży, tak jak genom ludzki (sześć miliardów par zasad), powstają miliony fragmentów o różnych wielkościach. Po wybarwieniu żelu barwnikiem odróżnienie poszczególnych fragmentów DNA jest niemożliwe – wszystkie one razem bowiem tworzą jedną smugę DNA. Dzieje się tak dlatego, że żaden z fragmentów (spośród milionów, które powstają) nie występuje w wystarczająco dużej ilości, by stał się widoczny jako oddzielny prążek. Lecz jeśli taki żel zostanie przeniesiony na arkusz nitrocelulozowy i zwiąże się z radioaktywną sondą DNA lub RNA, odpowiadający jej komplementarny fragment genomowego DNA ujawni się jako radioaktywny pojedynczy prążek w miejscu właściwym dla swojej wielkości. Wystarczy kilka milionowych części grama całkowitego genomowego DNA. Technika ta – hybrydyzacja genomowa (blotting genomowy) odgrywa bardzo ważną rolę wśród nowoczesnych metod tworzenia map genetycznych. Jest również podstawową techniką diagnozowania wielu chorób genetycznych i wirusowych; stosuje się ją także w medycynie sądowej do identyfikacji zarówno ofiar, jak i sprawców przestępstwa. W dalszych rozdziałach będziemy odwoływali się do różnych metod umożliwiających wykrywanie i identyfikację RNA i białek.
       Pełne poznanie struktury, sposobu działania oraz ewolucyjnej przeszłości wybranego odcinka genomowego DNA zależy od znajomości jego sekwencji nukleotydowej, którą można określić wykorzystując jego sklonowany odpowiednik. Pod koniec lat siedemdziesiątych, wkrótce po wprowadzeniu technik rekombinacji DNA, opracowano szybkie i dokładne metody określania kolejności nukleotydów w DNA. Dzisiaj w zasadzie nie ma żadnych problemów z zsekwencjonowaniem jakiejkolwiek cząsteczki DNA, niezależnie od jej długości. Sekwencje odcinków DNA liczących setki, a nawet tysiące nukleotydów oznacza się w sposób rutynowy. Zdolna osoba może sekwencję DNA liczącą kilka tysięcy par zasad określić w ciągu tygodnia z dokładnością ponad 99,9 procent (czyli z jedną źle oznaczoną zasadą na tysiąc). Co więcej, opracowano już automatyczne urządzenia takie dostarczające informacji o sekwencjach; jak się oczekuje, urządzenia takie uproszczą i ułatwią procedury określania sekwencji DNA i uwolnią badaczy od nudy towarzyszącej takiej pracy.2
       Ale nawet stosując obecnie dostępne metody, określono już ponad 89 milionów par zasad sekwencji DNA z wielu różnych organizmów (dane z maja 1992).3 Informacje te przechowywane są w ogólnie dostępnych scentralizowanych komputerowych bankach danych w Stanach Zjednoczonych i Europie. Spośród 89 milionów par zasad około 16 milionów reprezentuje odcinki znajdujące się w różnych miejscach genomu człowieka. Jest to punkt wyjścia dla wielkiego przedsięwzięcia polegającego na ustaleniu w nadchodzących latach sekwencji całego genomu ludzkiego.
       Tęsknotę biologów za chemiczną precyzją podsyca rosnąca liczba informacji o sekwencjach. Dane te są jednak bezużyteczne dopóty, dopóki nie wykryje się ich biologicznego znaczenia. Z pomocą przychodzą komputery: istnieją programy, które łatwo rozpoznają długie regiony kodonów zdolnych do translacji, mogących świadczyć o występowaniu tam genu kodującego białko. Programy te potrafią również rozpoznawać sekwencje regulatorowe, czyli m. in. promotory i terminatory. Programy poszukujące są szczególnie efektywne przy identyfikacji powtarzalnych sekwencji DNA, które powszechnie występują w genomach eukariotycznych, podobieństw między sekwencjami oraz miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne. Analogiczne programy potrafią porównywać daną sekwencję z wszystkimi innymi zawartymi w banku danych. Istnieją programy, które pokazują, na jaką sekwencję polipeptydu mogłaby ulec translacji dana sekwencja DNA lub wskazują wiele różnych sekwencji DNA, które – w teorii – mogłyby kodować dany polipeptyd (pamiętajmy, że kod genetyczny jest zdegenerowany, czyli że jeden aminokwas jest kodowany przez więcej niż jeden kodon). Inne programy przewidują, które regiony w pojedynczej nici RNA są najbardziej predestynowane do formowania obszarów dwuniciowych dzięki łączeniu się komplementarnych zasad; w ten sposób dostarczają modeli zwiniętych cząsteczek, takich jak tRNA czy rRNA. Zapotrzebowanie na coraz bardziej wyrafinowane techniki komputerowe nasilające się wraz ze wzrostem liczby danych dotyczących sekwencji nukleotydowych sprawia, że współpraca między matematykami, informatykami a biologami nabiera coraz większego znaczenia.

1 Po polsku znaczy to tyle, co sporządzanie odbitki, odcisku. Termin ten odnosi się bowiem do techniki przenoszenia układu fragmentów badanego DNA na filtr nitrocelulozowy, który poddawany jest dalszej analizie. W polskim tłumaczeniu używa się raczej terminu „hybrydyzacja”. Odnosi się on co prawda do następnego etapu tych badań, ale też blot (odcisk) sporządza się wylącznie w celu dalszych analiz. Metodę identyfikacji fragmentów DNA nazwano metodą Southerna – opracował ją bowiem E. M. Southern. Podobną metodę stosowaną wobec RNA nazwano (wykorzystując grę słów) metodą Northern. Jest jeszcze tzw. metoda Western, służąca identyfikacji białek za pomocą określonych przeciwciał (przyp. tłum.)
2 Zautomatyzowane aparaty do sekwencjonowania są obecnie wykorzystywane powszechnie. Dzięki tym technikom coraz sprawniej przebiega realizacja projektów poznania genomów, między innymi Programu Poznania Ludzkiego Genomu (przyp. tłum.)
3 W październiku 1996 roku znano już 1 021 211 sekwencji nukleotydowych różnej długości pochodzących z genomów różnych organizmów. Łączna długość tych odcinków DNA wynosi 651 972 984 pary zasad (przyp. tłum.)
góra strony
poprzedni esej następny esej
Wiw.pl  |  Na bieżąco  |  Informacje  |  Co nowego  |  Matematyka i przyroda  |  Astronomia  |  Biologia  |  Fizyka  |  Matematyka  |  Modelowanie rzeczywistości  |  Humanistyka  |  Filozofia  |  Historia  |  Kultura antyczna  |  Literatura  |  Sztuka  |  Czytaj  |  Biblioteka  |  Delta  |  Wielcy i więksi  |  Przydatne  |  Słowniki  |  Co i gdzie studiować  |  Wszechświat w obrazkach