Biologia
  Wiw.pl   Na bieżąco:  Informacje   Co nowego   Matematyka i przyroda:  Astronomia   Biologia   Fizyka   Matematyka   Modelowanie rzeczywistości   Humanistyka:  Filozofia   Historia   Kultura antyczna   Literatura   Sztuka   Czytaj:  Biblioteka   Delta   Wielcy i więksi   Przydatne:  Słowniki   Co i gdzie studiować   Wszechświat w obrazkach    
 Jesteś tutaj:  Wirtualny Wszechświat > Biologia > Genetyka > Genetyka molekularna 
  Indeks
Genetyka
Historia odkryć . . .
Podstawy genetyki
Genetyka molekularna
Klonowanie genów
Sekwencjonowanie . .
Struktura genu i . . .
Wielkość genomu
Specjalistyczne
metody genetyki
molekularnej
PCR
RFLP
Czynniki . . .
Geny i ewolucja
Świat wirusów i . . .
Inżynieria genetyczna
Słowniczek
  Źródło
Wybrane fragmenty pochodzą z książki
Język genów autorstwa Paul'a Berg'a i Maxine Singer


  PCR
 
Powielanie DNA bez klonowania
 
C
ały czas podkreślaliśmy, że klonowanie molekularne genowego DNA umożliwia osiągnięcie dwóch głównych celów. Po pierwsze – oddzielenie dowolnego segmentu DNA od pozostałych, po wtóre – powielenie wybranych odcinków DNA. Po sklonowaniu określonego genu lub regionu DNA i poznaniu jego sekwencji często można wykrywać niektóre rodzaje mutacji dzięki zmianie wzoru prążków, powstającego w wyniku pocięcia DNA przez różne enzymy restrykcyjne, a następnie ich elektroforezie, przeniesieniu na filtr nitrocelulozowy i hybrydyzacji ze specyficzną sondą. Jest to możliwe w przypadku większości zmian w DNA, polegających na utracie par zasad (delecji), wstawieniu nowych (insercji) lub ich rearanżacji. W ten sposób da się wykryć nawet zmianę pojedynczej pary zasad, o ile zmiana ta eliminuje lub tworzy miejsce rozpoznawane przez jeden lub kilka enzymów restrykcyjnych. Jak jednak wykryć mutacje, które choć zmieniają działanie genów, nie prowadzą jednak do zmiany wzoru prążków po pocięciu tego regionu różnymi enzymami restrykcyjnymi? W jaki sposób można je odnaleźć bez sekwencjonowania całego regionu?
       Problem ten przezwyciężono dzięki opracowaniu nowej techniki nazwanej PCR (z ang.: polymerase chain reaction – łańcuchowa reakcja polimerazy). PCR umożliwia syntezę milionów, a nawet miliardów kopii każdej sekwencji genomowego DNA w czasie krótszym niż kilka godzin. Istotną zaletą tej techniki jest fakt, że wybrany do powielania segment DNA nie musi być oddzielony od reszty genomowego DNA przed rozpoczęciem amplifikacji. Po powieleniu segment z łatwością daje się oddzielić od reszty genomowego DNA (który nie został powielony) dzięki elektroforezie na żelu. W pewnym sensie procedura PCR zastępuje klonowanie, ponieważ sekwencję nukleotydową można określić bezpośrednio na powielonym fragmencie. Można również wykrywać i lokalizować zmiany sekwencji porównując zdolności powielonego segmentu do łączenia się z nie zmutowaną sekwencją, używając krótkich jednoniciowych sond DNA.
       Taka analiza umożliwia badania przesiewowe DNA poszczególnych osobników na występowanie lub nieobecność częstych mutacji w znanych genach. Na przykład w prawidłowo powielonym segmencie DNA wykrywa się zamianę pojedynczej pary zasad w genie β-globiny, która powoduje anemię sierpowatą, albo niewielką delecję związaną z najczęstszą formą mukowiscydozy. PCR znacznie ułatwia również analizę wzorów RFLP w celu wykrywania sprzężeń genetycznych wybranych obszarów genomu.
       Niezwykła wybiórczość i wydajność amplifikacji metody PCR jest uzupełnieniem procedur analitycznych, o których wspominaliśmy powyżej. Połączenie tych metod umożliwia badanie pojedynczego genu lub krótkiego segmentu w jego obrębie, nawet jeśli cały dostępny do analiz DNA pochodzi z zaledwie jednej komórki. Metodę PCR wykorzystuje się obecnie powszechnie do wykrywania infekcji wirusowych, również obecności wirusa HIV-1 we krwi pacjentów chorych na AIDS (lub podejrzewanych o chorobę); do badania samoczynnie powstających nowotworów ludzkich, aby określić ewentualne zmiany w sekwencji genów kontrolujących wzrost i podział komórek, oraz przed przeszczepieniami, do określania typu genów, od których zależy układ zgodności tkankowej. PCR okazała się również potężnym narzędziem medycyny sądowej, o czym piszemy w dalszej części rozdziału, dzięki temu, że próbka niezbędna do wykonania takich badań może być znacznie mniejsza niż wymagają tego analizy bezpośrednie.
Amplifikacja określonych odcinków DNA metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR)
       Rycina obok ilustruje zasady metody PCR. Jej podstawowym celem jest równoczesne kopiowanie dwóch komplementarnych nici DNA w wybranym regionie. Początkowo więc obie nici poddaje się denaturacji (rozpleceniu) przez podgrzanie. Następnie pojedyncze nici miesza się z dużą ilością dwóch rodzajów krótkich jednoniciowych fragmentów DNA i pozwala się mieszaninie na połączenie się (renaturację) w obniżonej temperaturze. Każdy rodzaj krótkich fragmentów tworzy pary zasad z komplementarną sekwencją na którejś z dwóch nici rozplecionego DNA na obrzeżach segmentu wybranego do amplifikacji. Owe krótkie odcinki DNA służą jako inicjatory (startery – przyp. tłum.) kopiowania pożądanej sekwencji; są wydłużane przez polimerazę DNA. Po tym pierwszym cyklu każda nić oryginalnego segmentu DNA została skopiowana jeden raz. Następnie proces się powtarza; mieszaninę znowu podgrzewa się, co powoduje rozplecenie całego dwuniciowego DNA i – po obniżeniu temperatury – połączenie się z nim nici inicjatorowych, nadal obecnych w mieszaninie, zarówno z odpowiadającymi im sekwencjami na oryginalnych niciach DNA, jak i na ich nowo wytworzonych kopiach. Teraz znowu polimeraza DNA wydłuża związane startery, kończąc w ten sposób drugi cykl kopiowania. W trzecim cyklu znowu powtarzają się te same etapy: denaturacja, renaturacja i synteza DNA, czego efektem jest dalsza amplifikacja odcinka położonego między dwoma jednoniciowymi starterami. W każdym cyklu ilość dwuniciowego DNA się podwaja. Już po czterech cyklach powielony fragment stanowi ponad 50% całego DNA obecnego w mieszaninie. Po 25–40 cyklach otrzymuje się znaczne ilości fragmentu wybranego do powielania. Zwykle uzyskuje się setki milionów kopii określonego segmentu DNA o długości od kilkuset do kilku tysięcy par zasad.
       Tę samą procedurę można wykorzystać do powielenia segmentu cząsteczki RNA, jeśli RNA został najpierw skopiowany na dwuniciowy DNA przez odwrotną transkryptazę.1 Technika PCR umożliwiła więc również analizę sekwencji mRNA transkrybowanego ze zmutowanego lub interesującego z innych względów genu.
       Połączenie szybkości, prostoty, czułości i wybiórczości uczyniło z PCR znakomitą metodę badania struktury różnych alleli genu w sytuacjach, w których nie można uzyskać dużej ilości materiału. PCR ułatwia również klonowanie odcinków DNA, które występują w genomie bardzo rzadko, a nawet genów, które są znane jedynie na podstawie sekwencji aminokwasowej kodowanego białka.

1 Odwrotna transkryptaza syntetyzuje tylko jedną nić cDNA; druga powstaje w trakcie PCR podczas pierwszego cyklu amplifikacji w efekcie działania polimerazy DNA (przyp. tłum.)
góra strony
poprzedni esej następny esej
Wiw.pl  |  Na bieżąco  |  Informacje  |  Co nowego  |  Matematyka i przyroda  |  Astronomia  |  Biologia  |  Fizyka  |  Matematyka  |  Modelowanie rzeczywistości  |  Humanistyka  |  Filozofia  |  Historia  |  Kultura antyczna  |  Literatura  |  Sztuka  |  Czytaj  |  Biblioteka  |  Delta  |  Wielcy i więksi  |  Przydatne  |  Słowniki  |  Co i gdzie studiować  |  Wszechświat w obrazkach