Biologia
  Wiw.pl   Na bieżąco:  Informacje   Co nowego   Matematyka i przyroda:  Astronomia   Biologia   Fizyka   Matematyka   Modelowanie rzeczywistości   Humanistyka:  Filozofia   Historia   Kultura antyczna   Literatura   Sztuka   Czytaj:  Biblioteka   Delta   Wielcy i więksi   Przydatne:  Słowniki   Co i gdzie studiować   Wszechświat w obrazkach    
 Jesteś tutaj:  Wirtualny Wszechświat > Biologia > Genetyka > Genetyka molekularna 
  Indeks
Genetyka
Historia odkryć . . .
Podstawy genetyki
Genetyka molekularna
Klonowanie genów
Sekwencjonowanie . .
Struktura genu i . . .
Wielkość genomu
Specjalistyczne
metody genetyki
molekularnej
PCR
RFLP
Czynniki . . .
Geny i ewolucja
Świat wirusów i . . .
Inżynieria genetyczna
Słowniczek
  Źródło
Wybrane fragmenty pochodzą z książki
Język genów autorstwa Paul'a Berg'a i Maxine Singer


  RFLP
 
RFLP
 
N
owe metody mapowania dużych genomów wykorzystują fakt, że alleliczne segmenty DNA na chromosomach homologicznych często różnią się nieco sekwencją nukleotydową. Różnice mogą polegać na wymianie pojedynczej pary zasad (na przykład z A–T na G–C), delecji lub insercji jednej lub kilku par zasad lub ich rearanżacji. Są one zwykle wykrywalne metodą Southerna. Jeśli na przykład różnice dotyczą sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny (jeden allel ma tę sekwencję, a drugi nie), to w rezultacie liczba par zasad pomiędzy miejscami cięć enzymu – w danym regionie DNA – będzie większa dla chromosomu niosącego allel, w którym miejsce to nie występuje. A w konsekwencji – wielkość fragmentu DNA, który łączy się z sondą pochodzącą z tego regionu genomu, będzie na odcisku genomowym różna dla obu alleli. Bywa też tak, że zmiana polega na całkowitym wypadnięciu sekwencji komplementarnej do sondy. W każdym z tych przypadków sklonowana sonda wiążąca się do tego regionu daje inny wzór, w zależności od tego, który allel jest obecny. Dla różnych osobników tego samego gatunku uzyskuje się więc różne wzory. Dwa różne wzory powstaną nawet z pary chromosomów homologicznych jednego osobnika, jeśli zawierają one różne allele. Fragmenty o różnych wielkościach, tworzone z różnych alleli przez poszczególne enzymy restrykcyjne, noszą nazwę restriction fragment length polymorphisms lub RFLPs (wymawiane jako „riflips”, co oznacza: polimorfizm miejsc restrykcyjnych). Analizę RFLP da się przeprowadzić na nawet bardzo niewielkiej ilości DNA uzyskanego z białych krwinek organizmów dorosłych lub z komórek płodu, które można pobrać w dość bezpieczny sposób przez nakłucie owodni lub biopsję kosmków kosmówki. Rycina poniżej pokazuje analizę RFLP ludzkiego genu ras (mutacje w tym genie często powodują nowotwory) u członków licznej rodziny.
Dziedziczenie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP) związane z ludzkim genem ras. Na kolorowym schemacie przedstawiono wzorzec dziedziczenia 4 alleli przez 3 pokolenia. Na zdjęciu odcisku DNA – ten sam wynik otrzymany metodą hybrydyzacji
       Jednym z zaskakujących odkryć dokonanych dzięki analizie RFLP jest fakt, że taki polimorfizm jest dość powszechny. Do tej pory zidentyfikowano kilka tysięcy takich przypadków. W sekwencji nukleotydowej genomów poszczególnych przedstawicieli jednego gatunku jest o wiele więcej różnic (a przeto i więcej alleli genów), niż mogliśmy sobie wyobrazić. Należy pamiętać, że początkowo genetyka człowieka mogła badać odmienne cechy, które miały łatwo zauważalne konsekwencje, takie jak kolor oczu czy niektóre rzadkie choroby. Obserwowano tylko kilka postaci danej cechy, zazwyczaj jedną lub dwie. Założenie, że osobniki mające taką samą postać danej cechy, a także, że osobniki chore na tę samą chorobę dziedziczną mają takie same allele, wydawało się uzasadnione. Ale, jak pokazuje analiza RFLP na rycinie, liczba różnych alleli jednego genu może być duża; w prezentowanym przykładzie są cztery allele. Podobne wyniki uzyskano u różnych pacjentów dotkniętych chorobą Taya-Sachsa; zidentyfikowano kilka różnych uszkodzonych form genu związanych z tą chorobą.
       Polimorfizm miejsc restrykcyjnych występuje zarówno w regionach kodujących, jak i nie kodujących. Oznacza to, że różnice między genomami osobników należących do jednego gatunku mogą być dość duże. Różnice mogą wystąpić w obrębie sekwencji regulujących transkrypcję, w intronach oraz w tych regionach genomu, których funkcje pozostają nieznane. Czasami daje to subtelne różnice osobnicze, kiedy indziej nie wywiera zauważalnego skutku.
       RFLP są zwykle dziedziczone zgodnie z prawami Mendla, tak więc każdy RFLP, nawet wykryty za pomocą sondy anonimowej, jest dla celów analizy genetycznej równoważny z mutacją. Wykorzystując RFLP, których jest mnóstwo, zamiast znanych mutacji, których jest niewiele, genetycy stopniowo wypełniają – ubogą dotychczas – ludzką mapę genetyczną. Odnosi się to również do map genetycznych ważnych użytkowo roślin, takich jak kukurydza czy pomidor. Dziedziczenie RFLP można śledzić dzięki analizie DNA członków dużych wielopokoleniowych rodzin, a nawet grup populacyjnych. Taka analiza nie wymaga, w przeciwieństwie do analizowania mutacji, występowania wyraźnie widocznych anomalii genetycznych, jakkolwiek RFLP mogą być użyte do mapowania razem z mutacjami i z aberracjami chromosomowymi.
       Do ustalenia sprzężeń między genami oraz do konstruowania map genetycznych zaczęto stosować już w początkach XX wieku analizę rekombinacji. Podstawową koncepcję można zilustrować następująco: na dwóch homologicznych helisach DNA są trzy geny: E, F i G. Każdy z nich ma dwa allele: E i e, F i f oraz G i g. Jeśli rekombinacja zachodzi z równym prawdopodobieństwem w przypadkowym miejscu na DNA, to im większa odległość między genami, tym większa szansa, że zostaną one podczas tego procesu rozdzielone. Jest bardziej prawdopodobne, że rekombinacja nastąpi między genami E i G niż E i F, po prostu dlatego, że E i G są położone dalej od siebie. Tak samo dzieje się, jeśli E, F i G to regiony zawierające RFLP, a nie geny. E, F i G mogą być również mieszanką RFLP i znanych genów. Używając różnych sklonowanych sond, metodą RFLP zdefiniowano około 60 miejsc, oddzielonych od siebie średnio o 3 miliony par zasad na mającym średnią wielkość ludzkim chromosomie 7.
Lokalizacja genu odpowiedzialnego za mukowiscydozę na chromosomie 7 w odniesieniu do zestawu markerów RFLP; nazwy markerów zostały nadane arbitralnie
       Mapa RFLP odegrała niepoślednią rolę w sprecyzowaniu położenia genu, którego złe funkcjonowanie powoduje mukowiscydozę, stosunkowo częstą ludzką chorobę genetyczną. Kiedy zlokalizowano go na chromosomie 7, jego dokładne położenie zmapowano w odniesieniu do serii markerów RFLP. Dzięki znajomości położenia genu udało się go sklonować i scharakteryzować kodowane przez niego białko, co doprowadziło do zrozumienia przyczyn jego wadliwego działania oraz opracowania nowych metod diagnostycznych i sposobów leczenia mukowiscydozy.
       Duże zainteresowanie polimorfizmem miejsc restrykcyjnych wiąże się z ich znaczeniem w diagnostyce chorób. Na przykład tam, gdzie różnica w sekwencji nukleotydowej między allelem dzikim a zmutowanym wywołuje RFLP, analiza ta staje się ważnym narzędziem diagnostycznym. Przykładem jest zmutowany gen β-globiny powodujący anemię sierpowatą. Rycina poniżej pokazuje układ prążków odcisku DNA u ludzi z normalną formą β-globiny oraz u posiadających formę powodującą anemię sierpowatą. Na rycinie uwidoczniono także sekwencje nukleotydowe obu genów we fragmencie zawierającym mutację. Równocześnie ze zmianą jednej pary zasad powodującą mutację znika miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Dde I. Po pocięciu enzymem Dde I normalnego DNA, a następnie po elektroforezie, przeniesieniu na filtr nitrocelulozowy i związaniu z radioaktywną sondą DNA, komplementarną do tego regionu β-globiny, widoczne są dwa radioaktywne prążki. DNA zmutowany daje tylko jeden prążek, ponieważ nie zawiera miejsca rozpoznawanego przez enzym. Pojedynczy prążek to pewna diagnoza występowania allelu powodującego anemię sierpowatą. Test ten umożliwia odróżnienie zdrowych ludzi, którzy mają dwa normalne allele, od nosicieli genu anemii sierpowatej, mających jeden gen uszkodzony i jeden prawidłowy oraz od tych ludzi, którzy mają obydwa geny uszkodzone i są chorzy na anemię sierpowatą.
Wykrywanie mutacji odpowiedzialnej za anemię sierpowatą w genie β-globiny metodą hybrydyzacji z ludzkim DNA pociętym enzymami restrykcyjnymi
       Polimorfizm miejsc restrykcyjnych, występujący w obrębie znanych zmutowanych genów ułatwia wykrywanie uszkodzeń genów, niestety sytuacja taka należy do rzadkości. Można jednak z powodzeniem zastosować w tym celu odcinek wykazujący RFLP położony w stosunkowo niewielkiej odległości od badanego genu (nawet jeśli odcinek ten można wykryć jedynie za pomocą sondy anonimowej), ponieważ taki RFLP i zmutowany gen zazwyczaj dziedziczą się razem, rzadko ulegając rozdzieleniu w wyniku rekombinacji podczas mejozy. Im mniejsza odległość dzieli RFLP od zmienionego genu, tym wyższa jest korelacja między dziedziczeniem RFLP i mutacji. Wróćmy jeszcze do poprzedniego przykładu i wyobraźmy sobie, że G to pozycja genu, który w formie zmutowanej (g) powoduje chorobę. Wyobraźmy sobie również, że e i f są allelami RFLP E i F. Jeżeli w wyniku analizy RFLP okazuje się, że płód ma allel f, to prawdopodobnie ma również gen zmutowany (g). Diagnoza genu choroby będzie mniej pewna, jeśli wykona się test na e RFLP, ponieważ e jest położony dalej od zmutowanego genu niż f.
       Analiza polimorfizmu miejsc restrykcyjnych umożliwia mapowanie, wykrywanie oraz identyfikowanie genów związanych ze słabo poznanymi chorobami dziedzicznymi, włącznie z takimi przypadkami, w których defekt molekularny nie jest znany. Aby opracować metody diagnostyczne, przeprowadza się analizę znanych i zmapowanych RFLP wśród członków dużych rodzin, o których wiadomo, że dziedziczą badaną chorobę. Dane poddaje się obróbce statystycznej, aby ustalić korelacje między dziedziczeniem poszczególnych RFLP a dziedziczeniem choroby. Jeśli poszukiwania zostaną uwieńczone sukcesem, gen związany z chorobą będzie można zmapować w określonym regionie odpowiedniego chromosomu. Jeśli kilka znanych RFLP należy do sekwencji oskrzydlających gen i znajdują się one wystarczająco blisko, możliwe bywa nawet sklonowanie genu. Dzięki analizie RFLP udało się, na przykład, ustalić dokładne położenie zmutowanego genu, odpowiedzialnego za dystrofię mięśniową Duchenne'a, na chromosomie X. Umożliwiło to sklonowanie normalnego genu. Następnie sekwencji sklonowanego genu użyto jako sondy do przeszukania biblioteki cDNA, skonstruowanego z mRNA pochodzącego ze zdrowych komórek mięśniowych. Odpowiedni cDNA został sklonowany i wstawiony do wektora ekspresyjnego; kodowane przez niego białko zostało zsyntetyzowane w E. coli (należało użyć sklonowanego cDNA, ponieważ w E. coli sklonowany gen nie dałby białka – komórki bakterii nie dysponują mechanizmem wycinania intronów). Białko o takich samych właściwościach znaleziono następnie w zdrowych komórkach mięśni szkieletowych, ale nie w komórkach mięśniowych chłopców chorych na dystrofię mięśniową Duchenne'a. Choroba ta jest spowodowana niezdolnością do syntezy białka, obecnie zwanego dystrofiną; jest ona wynikiem mutacji w genie dystrofiny. Taki sam ciąg doświadczeń, prowadzący do identyfikacji produktu zmutowanego genu, rozpoczynając od jego lokalizacji, stosuje się w przypadku innych chorób genetycznych, których przyczyny są nieznane. Innym przykładem wykorzystania tej metody jest lokalizacja genu mukowiscydozy. Istnieją obecnie uzasadnione nadzieje, że badania uszkodzonych białek umożliwią opracowanie metod terapii nieuleczalnych dotychczas chorób.
góra strony
poprzedni esej następny esej
Wiw.pl  |  Na bieżąco  |  Informacje  |  Co nowego  |  Matematyka i przyroda  |  Astronomia  |  Biologia  |  Fizyka  |  Matematyka  |  Modelowanie rzeczywistości  |  Humanistyka  |  Filozofia  |  Historia  |  Kultura antyczna  |  Literatura  |  Sztuka  |  Czytaj  |  Biblioteka  |  Delta  |  Wielcy i więksi  |  Przydatne  |  Słowniki  |  Co i gdzie studiować  |  Wszechświat w obrazkach