Biologia
  Wiw.pl   Na bieżąco:  Informacje   Co nowego   Matematyka i przyroda:  Astronomia   Biologia   Fizyka   Matematyka   Modelowanie rzeczywistości   Humanistyka:  Filozofia   Historia   Kultura antyczna   Literatura   Sztuka   Czytaj:  Biblioteka   Delta   Wielcy i więksi   Przydatne:  Słowniki   Co i gdzie studiować   Wszechświat w obrazkach    
 Jesteś tutaj:  Wirtualny Wszechświat > Biologia > Genetyka > Genetyka molekularna 
  Indeks
Genetyka
Historia odkryć . . .
Podstawy genetyki
Genetyka molekularna
Klonowanie genów
Sekwencjonowanie . .
Struktura genu i . . .
Wielkość genomu
Specjalistyczne . . .
Czynniki . . .
Geny i ewolucja
Świat wirusów i . . .
Inżynieria genetyczna
Słowniczek
  Źródło
Wybrane fragmenty pochodzą z książki
Język genów autorstwa Paul'a Berg'a i Maxine Singer


  Określanie wielkości genomu, cd.
 
       Geny globinowe były jednymi z pierwszych genów ssaków sklonowanych za pomocą metod rekombinacji DNA. Hemoglobina stanowi ponad 90% białek w czerwonych krwinkach, komórkach wyspecjalizowanych w wytwarzaniu tego jednego białka. Dlatego też zdecydowana większość mRNA obecnego w czerwonych krwinkach koduje polipeptydy α- i β-globiny. Ponieważ mRNA dla obu typów globin łatwo było wyizolować, stały się one wygodnym źródłem materiału do stworzenia sond molekularnych używanych do odszukania – w genomowej bibliotece DNA – klonów przenoszących odpowiednie geny globinowe. Niektóre z tych klonów zawierały również dodatkowe fragmenty DNA leżące po obu stronach genów w genomie. Te tzw. odcinki flankujące (oskrzydlające) zostały tym samym sklonowane i mogły być wykorzystane jako sondy do wyizolowania z bibliotek genomowych kolejnych fragmentów genomowego DNA położonych dalej wzdłuż chromosomu. Powtarzając wielokrotnie tę procedurę, można było „kroczyć” wzdłuż chromosomu i zrekonstruować cały region zawierający 65 000 par zasad i obejmujący pięć ludzkich genów z rodziny β-globin. Następnie zsekwencjonowano cały sklonowany DNA, określając położenie eksonów, intronów, elementów regulatorowych, a także elementów rodzin bardzo licznych sekwencji powtarzalnych. Kompletna sekwencja 65 000 par zasad stanowi ostateczną mapę fizyczną tego obszaru ludzkiego genomu.
       Obszar zawierający geny globinowe, na wyższym poziomie organizacji, zlokalizowano na chromosomie 11 za pomocą dwóch powszechnie stosowanych technik. Jedna z nich polega na związaniu wyznakowanej fluorescencyjnie sondy molekularnej z ludzkimi chromosomami metafazowymi. Mikroskopowe badanie chromosomów ujawnia wtedy miejsca związania sondy jako fluoryzujące plamki na jednolicie zabarwionym tle. W tym przypadku sonda β-globinowa „rozświetliła” jedynie parę chromosomów 11. Druga technika wykorzystuje komórki hodowane w laboratorium, które zawierają wszystkie chromosomy danego gatunku oraz tylko jeden lub ograniczoną liczbę chromosomów drugiego gatunku. Jeśli będzie to na przykład cały komplet chromosomów mysich i ludzki chromosom 11, to w preparacie DNA uzyskanym z takich komórek odnajdzie się ludzkie geny β-globinowe. Jeśli będzie obecny inny ludzki chromosom, ludzkiego genu dla β-globiny nie wykryje się. Tak więc wiążąc sklonowaną sondę DNA z zestawem komórek mysich, z których każda ma inny ludzki chromosom, można wykryć chromosom zawierający konkretne sklonowane geny (lub inne sekwencje DNA). Obecność lub brak genu określa się metodą Southerna. Do hybrydyzacji DNA izoluje się z komórek, a sondą DNA jest, na przykład, sklonowany gen ludzkiej β-globiny.
Mapy skupień genów ludzkich kodujących polipeptydy hemoglobinowe (grecka litera ψ – psi – oznacza pseudogeny)
       Mapa kilku genów β-globinowych przedstawiona na rycinie powyżej jest mapą fizyczną (molekularną). Gdyby zaznaczono wszystkie szczegóły, pokazałaby również oskrzydlający DNA, eksony, introny, sekwencje regulatorowe, sekwencje rozpoznawane i przecinane przez enzymy restrykcyjne i wreszcie sekwencję kodującą. Tego rodzaju mapy różnią się zasadniczo od klasycznych map genetycznych, które pokazują względne położenie genów na chromosomie, a nie szczegóły molekularne. Klasyczną mapę genetyczną tworzy się na podstawie częstości rekombinacji. Jej opracowanie zależy więc od występowania takich mutacji, które przejawiają się jako rozpoznawalne zmiany w łatwo dostępnych dla obserwacji strukturach i funkcjach organizmu. Natomiast mapę fizyczną tworzy się za pomocą sklonowanych odcinków DNA, nawet jeśli ich związek z cechami organizmu nie jest znany. W ustaleniu położenia genu na chromosomie pomaga często porównanie mapy genetycznej z fizyczną. Może to doprowadzić do sklonowania genu, który uprzednio był znany tylko ze skutku, jaki wywierał na organizm. Mając już sklonowany gen można w laboratorium zsyntetyzować kodowane przezeń białko, wykorzystując wektor ekspresyjny, a następnie badać znaczenie genu i jego białkowy produkt.
       Niezwykłe możliwości badawcze, jakie daje zestawienie map fizycznych z genetycznymi, naukowcy uświadomili sobie w połowie lat siedemdziesiątych, podczas prac nad genomami wirusowymi. Dzięki tym metodom dokładnie poznano cykle życiowe kilku wirusów. Podobne postępowanie będzie miało podstawowe znaczenie dla zrozumienia jak działają skomplikowane, złożone genomy, na przykład ludzki. Dlatego też prowadzone są intensywne prace mające na celu sporządzenie dokładnej mapy fizycznej i genetycznej genomu człowieka. Zdobywanie takich danych wiąże się z koniecznością pokonania wielu barier zarówno natury technicznej, jak i konceptualnej, jednak największym wyzwaniem jest ogrom tego przedsięwzięcia.
Porównanie mapy restrykcyjnej (fizycznej) i genetycznej (klasycznej) genomu E. coli
       Pierwszym krokiem do sporządzenia kompletnej mapy fizycznej jest przedstawienie genomu (lub pojedynczego chromosomu) jako uporządkowanego zestawu fragmentów restrykcyjnych. Mapa fragmentów restrykcyjnych chromosomu E. coli, którego długość wynosi niemal 4,5 miliona par zasad, została już skonstruowana. Cały genom zawarty jest w 21 fragmentach wytwarzanych przez takie enzymy restrykcyjne, które przecinają DNA stosunkowo rzadko. Na mapie każdy z 21 fragmentów jest oznaczony dużymi literami. Ich położenie na kolistym chromosomie ustalono dzięki połączeniu metod genetycznych z biochemicznymi. Aby określić, jakie geny występują w poszczególnych fragmentach, jako sondę do hybrydyzacji DNA zastosowano segmenty znanych genów. Niektóre geny zaznaczono na mapie genetycznej. Gen gal, na przykład, znajduje się na odcinku P. Ponieważ do tej pory na mapie genetycznej zlokalizowano około 1000 genów E. coli, można już szczegółowo skorelować mapę genetyczną i fizyczną. Każdy nowo odkryty gen E. coli da się obecnie umieścić na tym lub innym fragmencie restrykcyjnym.
       Podobne podejście stosuje się do ustalania map molekularnych większych, bardziej złożonych genomów eukariotycznych. Jednak ze względu na większe rozmiary genomów trzeba je najpierw podzielić na jednostki, które są łatwiejsze do badań. Genom E. coli ma przecież tylko niecałe 4,5 miliona par zasad, podczas gdy liczne genomy roślin i zwierząt są blisko tysiąc razy większe. Jedna z metod polega na izolacji poszczególnych chromosomów i konstruowaniu ich map fizycznych. Mapowanie można ułatwić sporządzając bibliotekę zrekombinowanego DNA badanego chromosomu. Można wtedy wykonać fizyczne mapy sklonowanych odcinków. Klony, które zawierają zachodzące na siebie odcinki DNA, wykorzystuje się następnie do ustalenia, w jakim porządku są one ułożone na chromosomie. Jednak w porównaniu z mapowaniem genomu E. coli mapowanie DNA nawet pojedynczych chromosomów ssaków jest zadaniem ogromnym. Jest łatwiej, jeśli sklonowane segmenty są stosunkowo duże. Dlatego powszechnie stosuje się sztuczne chromosomy drożdżowe, dzięki którym można klonować segmenty większe niż 500 000 par zasad2, natomiast w wektorach fagowych można sklonować najwyżej około 40 000 par zasad.
       Otrzymano już mapy miejsc restrykcyjnych (a więc mapy fizyczne) dużych regionów dwóch niewielkich genomów eukariotycznych: nicienia Caenorhabditis elegans i drożdży piekarskich; mapy te są przechowywane w skomputeryzowanych bankach danych. Zachodzące częściowo na siebie odcinki DNA reprezentowane przez klony pokrywają ponad 95% obu genomów. Doświadczenie zdobyte podczas prac nad tymi małymi genomami wykorzystuje się do mapowania genomów myszy, człowieka, kukurydzy i innych organizmów.
       Zachodzące na siebie klony, uzyskane podczas mapowania, będą zastosowane do wyznaczenia kompletnej sekwencji nukleotydowej genomów. Kolekcja sekwencji ustalonych przy okazji różnych badań stale się powiększa. Do maja 1992 roku w centralnym komputerowym banku danych zapisano około 16 milionów par zasad sekwencji3 pochodzących z regionów rozrzuconych po ludzkim genomie oraz wiele danych dla drożdży, muszki owocowej i myszy.
       Rozpoczęto już zestawianie map fizycznych z mapami genetycznymi, podobnie jak u E. coli, korzystając ze sklonowania i zmapowania genów metodami genetycznymi. Mapy genetyczne organizmów o stosunkowo niewielkich genomach, takich jak drożdże piekarskie, nicienie i muszki owocowe zawierają już dość dużo danych. Porównanie ze sobą map genetycznych i fizycznych umożliwia klonowanie genów, których funkcja i względne położenie na chromosomie zostały określone, ale kodowany przez nie produkt pozostaje nieznany. Poznano na przykład u muszki owocowej taką mutację, która powoduje nienormalny rytm okołodobowy, a u samców zmienia ponadto częstość pieśni godowej. Stwierdzono więc istnienie genu decydującego o cykliczności zachowań. Następnie zlokalizowano go metodami genetyki klasycznej, na chromosomie X, po czym sklonowano sekwencje znajdujące się w jego sąsiedztwie. Porównując mapy fizyczne muszki dzikiej i zmutowanej, można było ustalić dokładne położenie genu i sklonować go. Wykorzystując wektory ekspresyjne uzyskano kodowane przez niego białko i w konsekwencji odkryto mechanizm kryjący się za tym interesującym i powszechnie występującym wśród organizmów rytmem zachowań.
       Przeniesienie technik mapowania do badań wielkich, złożonych genomów roślin i zwierząt kręgowych, z człowiekiem włącznie, stanowi wielkie wyzwanie: z jednej strony – ogromne rozmiary tych genomów, z drugiej – ubóstwo markerów genetycznych. W odniesieniu do człowieka problemy są jeszcze większe, ponieważ w tym przypadku hodowla doświadczalna z mutagenezą i krzyżowaniem osobników jest nie do przyjęcia. Genetyka człowieka sprowadzała się w przeszłości do badań nielicznych dużych, wielopokoleniowych rodzin, u których z wysoką częstością występowały pewne choroby. Przyjęto, że w rodzinach tych przenoszone są specyficzne, ujawniające się mutacje, a sposób ich dziedziczenia może pomóc w wyznaczeniu sprzężenia genów i ustaleniu map genetycznych. Ponieważ jednak rodziny tego typu występują rzadko, możliwości poznawania ludzkiej genetyki tą drogą były bardzo ograniczone, a brak odpowiednich ludzkich map genetycznych udaremniał próby wczesnego wykrywania chorób genetycznych. Jeszcze do niedawna wiarygodne procedury diagnostyczne dotyczące okresu płodowego obejmowały tylko kilka chorób genetycznych. Na przykład zbadanie chromosomów w komórkach płodu umożliwia wykrycie zespołu Downa – choroba ta nie jest związana z mutacją, lecz klasyfikuje się ją jako chorobę genetyczną, ponieważ spowodowana jest występowaniem nadliczbowej kopii chromosomu 21. Innego przykładu dostarcza choroba Taya-Sachsa, której przyczyną jest brak pewnego niezwykle ważnego, a łatwo wykrywalnego enzymu. Zapobiega on gromadzeniu toksycznych związków powstających podczas rozwoju błon komórek nerwowych.
       Postęp prac nad mapowaniem genomu ludzkiego umożliwiło dopiero sklonowanie licznych fragmentów ludzkiego DNA zawierających geny oraz ustalenie ich położenia na chromosomach. Jak już pisaliśmy wcześniej, istnieją dwie metody, które w połączeniu ze sklonowanymi sondami DNA czynią mapowanie pojedynczych kopii sekwencji DNA na chromosomie ludzkim niemal rutynową procedurą. Obie techniki są całkowicie niezależne od badań mutacji i drzew rodowych. Mapowanie takie można przeprowadzić nawet wtedy, gdy funkcja sklonowanej sondy DNA jest nieznana – jest to tak zwana sonda anonimowa.
       Mimo że liczba genów i segmentów DNA, których miejsce na ludzkiej mapie genetycznej zostało już określone, ciągle rośnie, mapa ta pozostaje wciąż bardzo uboga. Zauważmy, że nawet jeśli zmapowano już 2100 ludzkich genów, każdy o długości średnio 10 000 par zasad (licząc razem eksony i introny), to jest to zaledwie 20 milionów spośród 3 miliardów par zasad w haploidalnym ludzkim genomie. Każdy z tych dwóch tysięcy genów jest zapewne oddzielony od swojego najbliższego zmapowanego sąsiada wieloma milionami par zasad. Obecnie znamy około 4000 ludzkich chorób genetycznych. Nawet jeśli uda się zmapować wszystkie warunkujące je geny, to i tak do uzyskania kompletnej mapy genetycznej ludzkiego genomu będzie wciąż bardzo daleko. Na szczęście niedawno opracowano metody, które umożliwiają sporządzenie dokładniejszych i bardziej użytecznych map genomu ludzkiego oraz złożonych genomów innych organizmów, m.in. takich ważnych z rolniczego punktu widzenia gatunków jak kukurydza. Metody te można wykorzystać w badaniach nad ludźmi, ponieważ nie wymagają eksperymentalnych hodowli ani odnalezienia licznych rodzin przenoszących określone choroby genetyczne. Pozwalają na diagnostykę schorzeń genetycznych tak u płodów, jak i u dorosłych ludzi, są również użyteczne przy badaniu rozkładu różnych alleli w wielkich populacjach.

2 W 1995 roku doniesiono o możliwości klonowania w YAC nawet odcinków długości 2 mln par zasad (przyp. tłum.)
3 Do października 1996 roku w banku tym zapisano prawie 652 miliony par zasad sekwencji różnych organizmów (przyp. tłum.)
góra strony
poprzedni esej
  
[1]
  
[2]
  
następny esej
Wiw.pl  |  Na bieżąco  |  Informacje  |  Co nowego  |  Matematyka i przyroda  |  Astronomia  |  Biologia  |  Fizyka  |  Matematyka  |  Modelowanie rzeczywistości  |  Humanistyka  |  Filozofia  |  Historia  |  Kultura antyczna  |  Literatura  |  Sztuka  |  Czytaj  |  Biblioteka  |  Delta  |  Wielcy i więksi  |  Przydatne  |  Słowniki  |  Co i gdzie studiować  |  Wszechświat w obrazkach